CART细胞疗法现阶段面临的挑战和新机

摘要

对复发难治的B细胞恶性肿瘤患者输注经过基因改造的嵌合抗原受体CAR的T细胞，这一疗法使得患者有很好的治疗响应和肿瘤缓解的临床获益。这是有种新的过继性T细胞疗法，其中人工修饰的嵌合抗原受体CAR激活T细胞的抗肿瘤抗体最终消灭肿瘤细胞。CAR-T疗法在血癌领域的成功，是FDA在年批准了首个CAR-T细胞治疗产品，应用在CD19阳性的白血病和淋巴肿瘤适应症。尽管CAR-T细胞是肿瘤免疫疗方的最新突破之一，但其特定的毒性限制了它被广泛的应用；同时，CAR-T细胞疗法在实体瘤领域的有效性差强人意，实体瘤领域缺乏有力的有效性，是由于肿瘤微环境免疫抑制能力强从而难以找到可靠的作用靶点。

在这篇综述中，我们会介绍新兴的嵌合抗原受体技术和其临床应用，还会介绍在应用CAR-T细胞治疗时的毒性反应，和在实体瘤治疗领域所遇到的障碍；此外还会介绍下一代CAR-T细胞疗法在改进安全性和有效性方面所采取的策略。

1简介

在近几十年里，某些肿瘤适应症，仅能依赖手术、化疗、放疗等传统手段来治疗。而免疫治疗（通过激发人体免疫系统从而识别和杀死恶性肿瘤细胞的治疗）方法的建立，改变了这一格局。癌症免疫疗法多种多样，包括单克隆抗体、淋巴细胞活化细胞因子、癌症疫苗、溶瘤病毒、双特异性抗体、过继性T细胞疗法，这些都将有可能成为彻底消除癌症的治疗手段。T细胞是一种合适的免疫细胞类型，由于其自身具有识别和杀死癌细胞的能力，它可以通过释放财报毒性颗粒和细胞因子从而激活癌细胞的凋亡通路。在早期，ACT这一疗法依赖自体肿瘤侵润淋巴细胞的移植，也就是将从患者的淋巴细胞体外扩增到有效剂量水平后在回输至患者体内。有报道称TILs的过继转移疗法是治疗黑色素瘤最有效的免疫治疗方法。随后的数据显示，TILs能够靶向新抗原，这进一步支持了临床获益。

首次尝试的工程T细胞是通过预设的肿瘤抗原亲和力的克隆T细胞受体。尽管这一工程细胞能够同时针对表面和细胞质肿瘤相关的蛋白，从而可能扩大其靶向抗原的种类；但TCR至于在主要组织相容性复合体MHC出现的情况下才能被激活。由于肿瘤细胞有调低MHCclassI分子表达的能力从而避免被免疫系统识别，因此肿瘤细胞也能逃过TCR的识别。嵌合抗原受体CAR就这样应运而生，用来克服TCR的这一限制。嵌合抗原受体CAR中，TCRs细胞内信号结构域的抗体衍生结合结构域具有高亲和力。

这种受体工程T细胞，在人工的干预下重新定向了其肿瘤相关抗原（TAAs）特异性和毒性，并且这些功能是独立于MHC的表达水平的。在这一框架下，对T细胞进行基因改造使其靶向CD19抗原，其在治疗复发难治的B细胞恶性肿瘤临床试验中表现出优异的效果。这些前所未有的临床获益，促使FDA在年下半年批准了两款靶向CD19的CAR-T产品。然而，尽管CAR-T细胞疗法在血液肿瘤中的临床获益没有受到质疑，但在治疗过程中产生的细胞因子释放综合征和神经毒性等是不能被忽视的，并且这些毒性发生的作用机制是不明确的。此外，CAR-T细胞疗法在实体瘤中的应用受到阻碍，已知的体内物理屏障和肿瘤微环境的情况严重阻碍了CAR-T细胞在实体瘤中的作用效果。因此在未来，克服CAR-T细胞治疗的安全性和在实体瘤中的有效性还有待持续研究和改进。

在本文中，我们将对这一新兴CAR-T细胞技术的发展、CAR-T细胞在临床的应用、以及最新的毒性反应机理的讨论、和下一代CAR-T细胞工程技术的优化等方面提供全面的阐述和讨论。另外，CAR-T细胞治疗在实体瘤中应用的最近进展也会阐述和讨论。

2嵌合抗原受体技术的发展

嵌合抗原受体CARs是一种混合抗原受体，在单个分子中T细胞的特异性被人工改造从而在人体内迅速扩增靶向特定肿瘤细胞的T细胞。事实上，这种T细胞通过基因操控赋予T细胞超生理特性，使其成为一个活跃的治疗平台迅速扩增和表达自体或者异体的T细胞。与TCR相比较，CAR不需要依赖肽处理来识别其目标抗原，而TCR严格依赖MHC的表达水平因此仅限于特定的人类白细胞抗原HLA表达背景产生效果。一旦CAR与肿瘤抗原结合，T细胞就会被激活迅速扩增并杀死靶癌细胞，这一过程并不依赖MHC或HLA的表达水平。这使得CAR-T细胞疗法可以应用于更广泛的人群，而不必考虑其HLA的类型。

CAR技术不断革新，其核心结构都会有一个多肽链包含两个部分：一个通过抗体衍生的抗原识别和TCR衍生的信号区域。嵌合抗原受体CAR的外键合区域通常由一个单链可变片段（scFvs）构成，包含目标反应性的Ab的通过共价键结合的轻链和重链所形成的灵活键。此外，在临床前研究中其它的结合作用区域如配体、生理受体、肽、纳米体和DARPins都可能产生作用效果。这些用于识别作用的基因序列决定了CAR的特异性与结合目标抗原的亲和能力。

细胞外包含CD3或CD8α人类分子的同二聚体可通过灵活铰链片段链接到跨膜区域。有报道称，CD8α跨膜序列的长度能够跨越瓣膜，但这里并没有发现其信号功能或者影响细胞因子的产生，或者扩增CAR-T细胞。此外，铰链区域还可以键合其它间隔物从而向T细胞表面延伸出去。间隔物的长短由结合位点与T细胞之间的距离决定。CAR-T细胞与靶向细胞的结合能力与CAR-T细胞结合后产生的CD45和CD的抑制磷酸化作用相关。目前，所有应用于临床试验的CAR都包含CD3蛋白复合物，来自TCR的信号转导部分作为细胞内的信号转到结构域。CD3链可在后续结合抗原的作用过程中激活T细胞的溶解活性。

2.1从第一到第三代CAR

第一代CAR依赖CD3活化T细胞，尽管CD3链的聚合水平足够激活T细胞达到有效剂量水平，但是T细胞增殖效率低体内持久性弱限制了它的应用场景，当然它相应的毒性也相对有限。随后的第二代和第二代CAR技术在细胞内通过结合一个或者两个结构域来增强其聚合功能，其体内的抗肿瘤有效性和扩增性都随之提高。这些新加入的共激信号使得T细胞有稳定和强大的细

胞因子反应，增加其细胞溶解作用和扩增能力。CD28和4-1BB是经常被使用和检测到的共激区域。在一项试验比较CD28和4-1BB的抗肿瘤机理中显示，4-1BB表达的CAR-T细胞表现了更持久的肿瘤抑制效果，甚至可以持续到肿瘤细胞全部消失后的时间，这一结果使得4-1BB表达的CAR-T细胞可以作为预防肿瘤复发的治疗。该研究的结果同时表明，基于CD28表达的CAR具有较高的克隆扩增和IL-2分泌效果，导致更强大的肿瘤致死活性从而更快的消除肿瘤；这表明它在早期癌症的缓解策略中有着潜在的优势。

2.2第四代CAR

第四代CAR-T细胞，被称为宇宙级的细胞因子介导杀手，是被设计成将在CAR与靶向抗原结合时能够释放改造基因的产品到肿瘤组织中。免疫调节分子如促炎症、细胞因子和酶的局部转移，使得T细胞浆免疫抑制肿瘤微环境转化为免疫耐受性肿瘤微环境。一种经常在CAR-T细胞中被过度表达的细胞因子是IL-12，它是一个非常有效的分子可以增强T细胞分泌IFNy、granzymeB和穿孔素perforin；并雇佣NK细胞去消除CAR不能识别的肿瘤细胞。与传统的CAR相比，IL-12过表达的CAR-T细胞在临床前的模型中表现出增强的抗肿瘤和扩增效果，尤其是在实体瘤模型中。在一项临床1期试验中，应用表达IL-12的anti-MUC16ectoCAR-T的细胞治疗，尽管结果呈现的有效性有限，而安全性非常好并没有发生不良事件。也有其它正在进行的临床试验来评估这一领域的应用效果。另外一个被熟知和报道的细胞因子是IL-18，它可以促使T细胞表达IFNy。在临床前的实验中表明，IL-18的基因表达可以增强T细胞的毒性和扩增能力。在这一领域，最近有报道称IL-18可以诱导T细胞对实体瘤的响应产生急性炎症。

2.3新颖的第五代CAR

最近，一种新颖的CAR被设计和开发出来，它沿用了第二代CAR的主干链增加了在CD3和CD28信号区域之间的IL-2受体域，同时在C末端的CD3处结合YXXQ序列。第五代的CAR的设计旨在同时激活TCR，共激域CD28，和细胞因子三重信号；因为这是T细胞结合抗原时被激活的前提条件。作者证实了在血液肿瘤和实体瘤模型中，与第二代CAR相比，第五代CAR通过基因改造增强了T小的增值、存活已经抗肿瘤效果。

3制造工艺

制造CAR-T细胞的第一步是收集去除白细胞的自体或异体的外周血细胞PBMC。然后获得富集CD3阳性的T细胞，例如通过离心的方式。纯化后，T细胞在抗CD3/CD28的激活单克隆抗体和富集IL-2的培养基中得到活化和扩增。也有其它的体外扩增方法，例如通过工程细胞K表达T细胞共激配体。最近有一个创新的方式被报道，通过由其表面附着脂质双层的二氧化硅组成的三维支架作为T细胞活化管道，这一方式被称为CD3/CD28的功能活化剂。这种方式促进了更高的克隆效果和抗原性。

T细胞被活化和扩增后，随后表达CAR的基因。多数在临床试验中应用的CAR-T细胞，是通过体外基因工程技术的。T细胞通过逆转录病毒载体，实现永久的基因组整合，进而可以长久的保持CAR表达能力。一种替代病毒介导的CAR传导的方式是通过非病毒质粒电穿孔的条约因子系统。简单的说，这种方式下的CAR结合是通过第二个DNA质粒形成的。这在一项治疗CD19阳性的B细胞恶性肿瘤临床试验中被评估。非基因改造的mRNA转染方式也用来表达CAR，但在这种方式下由于被转染的基因消失的很快，因此在临床应用中需要多次反复输注CAR-T细胞以获得很好的临床收益。

最近在体内即使产生靶向和基因修饰的T细胞方法被开发和报道。例如，使用具有抗CD3抗体片段的可重复利用的T细胞，通过聚合物DNA纳米载体的方法被尝试和评估。在机型淋巴母细胞白血病的小鼠模型中，通过静脉注射携带基因编码纳米颗粒的CAR，该治疗中十分之七的小鼠肿瘤被根除。值得注意的是，这一抗肿瘤效果，与传统的通过体外病毒转导方式的CAR-T细胞治疗效果相当。Agarwal和他的研究团队也证实了CD8阳性的T细胞可以在体内通过慢病毒

载体八项特异性的方式产生。在报道的人源化小鼠模型中，这种靶向CD8的抗CD19CAR的仅仅一次输注，就可以将在骨髓和肾脏的肿瘤细胞全部清除。

4临床应用

最早的CAR-T细胞治疗是针对晚期实体瘤即晚期上皮性卵巢癌和转移性肾细胞癌的患者，在结果报道中没有很好的临床获益而毒性反应却很显著。实际上，CAR-T细胞免疫疗法获得突破性的进展，是将抗CD19自体表达的CAR-T细胞应用在CD19阳性的B细胞白血病和淋巴瘤适应症上，结果的确显示了非常好的抗肿瘤效果。CD19抗原是激活正常B细胞发育的受体，由于其在肿瘤细胞中的出现频率、均一性和表达水平，被选为治疗B细胞恶性肿瘤的靶点。值得注意的是，CD19的表达尽在B细胞中，健康的B细胞在CAR被激活时也会被消除，因此接受抗CD19CAR-T细胞治疗的患者可能会产生B细胞再生障碍。尽管如此，这种靶向非肿瘤细胞的作用并不是危机生命的，在临床应用上可以通过注射免疫球蛋白是患者得到缓解；这种做法更从旁证明了CD19可以作为治疗CD19阳性的血液肿瘤的合适靶点。

比较抗CD19CAR-T细胞治疗在各种复发难治的B细胞白血病如急性淋巴白血病、非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤的临床评价中，DLBCL的患者从治疗中获益最大，达到50%-90%的缓解率。相反，慢性淋巴细胞白血病的患者对抗CD19的CAR-T细胞治疗的临床反应没有呈现一定的规律。此外，接受自体干细胞移植的抗CD19CAR-T细胞治疗在多发性骨髓瘤中的应用也在评估当中。如最近结束的一项一期试验，报道称这一疗法与标准疗法相比在患者相应率方面有很好的改善。

在CD19隐性、CD19缺失或者表达水平过低的患者中，抗CD19CAR-T细胞的抗肿瘤效果并不活跃或者很快复发甚至会造成B细胞再生功能的丢失，主要有以下三个原因：1）诱导宿主对CAR转基因的免疫；2）在治疗下CD19隐形B细胞发生变异；3）肿瘤诱导的抵抗机制。为了克服这些挑战，除靶向CD19之外，靶向CD22、CD20、lgk、ROR1等临床前和临床研究都在进行中。例如在一项临床一期评估靶向CD22的CAR-T细胞在复发难治的B-ALL患者中获得了很好的完全缓解率。这一项试验第一次揭示了抗CD22的CAR-T细胞治疗与抗CD19的CAR-T细胞治疗有相对可比的抗肿瘤效果和安全性数据。针对其它血液肿瘤的治疗，如AML、MM，最多被研究的靶点包含CD、CD33、CD7；其次是BCMA和CD.

最后，在CAR-T细胞试验中一个被广泛应用的给药方案是在输注过继性T细胞之前口服可以抑制细胞毒性药物。研究表明，预先输注的淋巴细胞可以增强CAR-T细胞在体内的有效性和持久性。

5CAR-T细胞技术的转化

5.1一流的CAR-T细胞技术

年8月FDA批准了第一款由诺华开发的CAR-T细胞疗法产品Tisagenlecleucel，也就是Kymriahtm用于治疗儿童和25岁以下成人的复发难治的B-ALL适应症。Tisagenlecleucel是一款含有4-1BB共激结构域的抗CD19CAR-T细胞产品，它在体内通过第二代编码基因对患者自体T细胞进行慢病毒转导。一项名为ELIANA评估抗CD19的CAR-T细胞治疗在r/rB-ALL患者的有效性和安全性的的国际多中心的II期试验的结果，最终很好的支持了FDA对此产品的批准上市。临床评估结果显示，在75位受试者中总缓解率为81%，响应持续时间为20个月。这一始料未及的成功极大的鼓舞了CTL在治疗其它B细胞恶性肿瘤的研究。去年FDA又批准了Kymriahtm治疗成人r／rB-NHL包含DLBCL，高水平B细胞淋巴瘤和滤泡淋巴瘤引起的DLBCL等适应症。一项名为JULIET的国际多中心试验的结果为这个获批提供了临床依据。这一临床试验的结果显示总有效率为52%，包含40%的完全缓解率；在安全性方面，没有患者由于治疗的不良事件、细胞因子释放综合征、神经毒性等造成死亡。在被美国FDA获批后的一年里，Kymriahtm也被欧盟批准用于以上提到的适应症。

另一个一流的抗CD19CAR-T细胞治疗产品名为Axicabtageneciloleucel被FDA获批，用于治疗成人的r／rB-NHL包含r／rDLBCL、转化滤泡淋巴瘤和原发性纵隔B细胞淋巴瘤。Axicabtageneciloleuce是Kite公司的产品，后来被Gilead收购；是一款单次输注的CD19第二代CAR-T细胞治疗产品，在体内通过自体细胞表达CD3/CD28。这项获批是在一项名为ZUMA-1的多中心试验提供的临床依据，其结果显示在名受试者中响应率为82%，包含54%的完全应答率。还有其它的临床试验在评估Yescartatm在治疗其它血液系统肿瘤的安全性和有效性。

5.2正在兴起的CAR-T细胞产品

FDA批准了第一个自体抗CD19的CAR-T细胞治疗产品，更加鼓舞了这一领域的技术发展。创新技术下开发的CAR-T细胞产品在临床前模型研究和临床中治疗CD19阳性白血病和其它癌症领域的研究层出不穷。

由Cellectic开发的UCART19后选产品，是一个从非HLA匹配的健康捐赠者体内获取的基于异体基因改造的T细胞技术。为了避免异体细胞的排斥作用，通过基因编辑技术TALEN可以解决。UCART19的临床应用得到了非常令人激动的结果，再仅有的两名婴儿受试者都得到了完全缓解。目前，这一技术应用在靶向CD19盒CD的候选产品开发并在临床试验中被评估。

尽管很多CAR-T产品应用在实体瘤治疗中的临床试验结果令人失望，仍然有很多后选产品给人希望。其中一个例子就是MustangBio的旗舰产品MB-，它是一款靶向与低存活率相关的胶质瘤抗原的IL13受体的4-1BBCAR-T细胞产品。在一项用MB-治疗复发性胶质母细胞瘤患者的临床试验中，显示正向的临床反应，在首次输注CAR-T细胞之后的7个月里患者出现全部的肿瘤消失。然而，尽管结果令人鼓舞，这名患者在随后的时间里肿瘤复发了，可能由于IL13Rα2表达水平下降。除MB-产品外，MustangBio的其它后选产品也在治疗实体瘤的临床试验评估中。

另一个创新型的产品是Celyad研发的CYAD-01和CYAD-，分别是基因编辑的自体和异体T细胞产品，通过表达NKG2D一种自然的杀伤集团激活受体作为抗原结合域。这些带有NKG2D的CAR有以下优势：1）与在肿瘤细胞中表达的NKG2D配体有很好的结合力，而这些配体在正常细胞中不表达；2）通过与天然共激分子DAP10结合产生信号，从而媲美二代CAR的功能。这两个CYAD-01和CYAD-产品目前都在临床一期试验中评估，用于治疗血液肿瘤和包括结直肠癌在内的实体瘤。

6CAR-T细胞毒性反应的潜在机制

尽管CAR-T细胞治疗用于复发难治的CD19阳性B细胞肿瘤的1/2期临床试验中得到很好的阳性响应结果，但是与这一疗法相关的特有毒性会发生，有时甚至是致命的。在包括ELIANA，JULIET和ZUMA-1的多个临床试验中，3／4级不良事件包括细胞因子释放综合征、发热性中性粒细胞减少、感染和神经毒性事件。在ELIANA试验中，两名患者经历神经毒性，其中一名患者经历脑病，另一名患者经历神经失常。事实上，细胞因子综合征和神经毒性是在CAR-T细胞疗法中最常被报道的毒性反应有时甚至危及生命，尤其是在抗CD19的治疗中。另一方面，CAR-T细胞治疗应用在血液系统恶行肿瘤中，会出现非肿瘤细胞的B细胞再生障碍的毒性反应，而这一反应在临床经验中可以被控制，也不是致命的。然而，非肿瘤细胞毒性出现在CAR-T细胞治疗实体瘤时的影响是显著的，将需要被进一步讨论。因此，文中以下的讨论仅针对细胞因子释放综合征和神经毒性提出的潜在机制。

6.1细胞因子释放综合征

6.1.1临床特征

在CAR-T细胞治疗中最常见的毒性是细胞因子释放综合征CRS。CRS，最早出现在输注后与CAR-T细胞激活和扩增、靶点识别以及随后被活化释放高浓度的炎症细胞因子有关，从而导致患者全身产生炎症反应。值得注意的是，这种细胞因子综合征在其它靶向T细胞治疗中也被观察到，如双特异性T细胞抗体BiTE，即抗CD19/CD3BiTEblinatumomab。

CAR-T细胞治疗导致的CRS与多种血清细胞因子的最高水平有关。在一项临床试验中，针对51例CTL患者的样本，检测特定血清因子包括IFNγ,IL-8,sIL-2Rα(solubleIL-2receptor-α),IL-6,sIL-6R(solubleIL-6receptor),sgp(serumglycoprotein),MCP1(monocytechemoattractantprotein1),MIP-1α(macrophageinflammatoryprotein1α),MIP-1β(macrophageinflammatoryprotein1β)andGM-CSF(granulocyte-macrophagecolony-stimulatingfactor)，结果提示在第一个月出现的严重CRS与这些因子水平相关。事实上，IFNγ,IL6,sIL-6R,sgpandsIL-1RA等因子在早期出现峰值水平可以作为CRS的预测性生物标记物。CRP在临床研究中也可以被认为是CRS不良事件发生和严重程度的可靠指标。

除细胞因子指标外，由于淋巴消耗引发的CAR-T细胞扩增，和肿瘤负担程度是与严重的CRS相关的两个因素。细胞因子风暴症状分为轻度和中度，包括发烧、低血压、心动过速、低氧、疲劳，甚至危及生命的不良事件例如弥散性血管凝血、多器官损伤如干毒性、肾衰竭、心血管疾病等。

6.1.2CRS病理学：IL-6和IL-1的关键作用

尽管CRS的发病机制并不清楚，最近更多的证据显示IL-6的关键作用，其生理功能是在细胞膜上鱼sIL-6R或者IL-6受体结合，从而诱导JAK／STAT信号通路激活。事实上，在几项不同的临床试验中都有报道称，输注抗CD19CAR-T细胞时的IL-6峰值浓度与严重CRS的发生呈现相关性。IL-6的作用进一步在抗IL-6RmAbtocilizumab的临床疗效中得到支持，该单抗可以阻止IL-6与IL-6R或者sIL-6R的结合。Tocilizumab被确立为缓解CRS的一线疗法，由于它可以在不降低CAR-T细胞活性的情况下缓解CRS症状；而做为二线治疗的systemic’corticosteroids却消除CAR-T细胞的抗肿瘤作用甚至使肿瘤细胞增殖。然而，目前尚不确定的是伴随sCRS的IL-6主要来自CAR-T细胞本身还是来自其它免疫细胞。

最近，利用人源化小鼠sCRS模型的临床前研究提出了一项新的机制解释，强调宿主源性髓细胞在CRS中起很大作用。一些作者认为，在发生CRS过程中，单核细胞是IL-6的主要来源而不是来自CAR-T细胞。在Norelli进行的一项临床前研究中提示，在输注抗CD19CAR-T细胞前破坏小鼠循环单核细胞，使得CRS的发生率和致死率得到完全抑制。惊奇的发现，预先破坏的单核细胞会导致CAR-T细胞表达的显著减少，这提示除了对CRS的发生起作用外，这些髓细胞对CAR-T细胞的抗肿瘤效果也起到作用。在时间序列分析中发现，IL-1一中单核细胞衍生的因子，实在IL-6出现的前24小时被释放的。已知IL-1可以诱导IL6的分泌，因此被CAR-T细胞激活的循环单核细胞衍生的细胞因子IL-1可能是CRS发病的第一个原因。这一假设很快被anakinra可以缓解CRS症状的效果下被支持，因为anakinra是IL-1受体拮抗剂。出乎意料的，anakinra可以对CRS之后发生的神经毒性起到保护作用，提示IL-1不仅是CAR-T细胞治疗毒性的关键因素，还可能成为药理学潜在靶点。

另一方面，Giavridis等人证明巨噬细胞而非单核细胞是CRS发生过程中IL-6的主要来源。肿瘤部位的CAR-T细胞和髓细胞的同时定位，是分泌IL-6和其它包括IL-1的促炎症因子的必要条件，这些细胞因子最终导致CRS的发生。这一结果提示CAR-T细胞治疗中发生的CRS，可能与在肿瘤内的骨髓浸润有关，而不是单纯依赖CAR-T细胞的超级活化。另外有趣的是，在CRS生理学现象中发现了巨噬细胞衍生的iNOS的直接参与。巨噬细胞呗IL-6或者IL-1激活后会产生高水平的iNOS，进而诱导异常的NO分泌，导致血管舒张和低血压；二者恰恰是CRS的临床特征。Anakinra在临床上的使用可以降低iNOS的水平从而预防CRS的致死几率；这再一次提示IL-1是合适的靶点既不影响CAR-T的抗肿瘤活性，又可以缓解CRS症状。

6.2神经毒性

6.2.1临床表征

神经毒性也被称为CAR-T细胞治疗相关的脑病综合征，是第二种发生频率极高且会危及生命的不良事件，通常发生在sCRS之后。最多被报道的神经毒性症状有混乱、失语、神经失常、嗜睡、抽搐、语言障碍、共激失调，严重情况下，患者可能会进展为癫痫或者脑水肿。尽管有共识说sCRS与神经毒性之间存在很强的关联性，由于患者在输注CAR-T细胞后出现CRS后发生神经毒性的风险很高，但对其潜在机理却知之甚少。

进来，学者开展了一项研究，旨在更好的分析和证明引起神经毒性的关键因素，并评估这些关键因素是否能够作为预测是否发生神经毒性不良事件的标志。在使用抗CD19CAR-T治疗的例病人中，发现53例病人在治疗的第一个月内出现至少一级的神经毒性事件。出现神经毒性事件的症状与其它临床试验报道的相吻合，尽管这些症状是可逆的，仍然有4例患者死于脑水肿、脑干出血或者皮质层坏死。根据多变量模型分析，患者的基线特征含有较高的肿瘤负荷、输注较高剂量的CAR-T细胞、或者患者本身有神经性疾病，这些因素增加了体内CAR-T细胞的扩增，被认为是发生神经毒性事件的高风险因素。并不奇怪的，患者在接受CAR-T细胞治疗后很快出现sCRS严重不良事件的，随后发生神经毒性的可能性更高。

6.2.2神经毒性的病理生理学：内皮细胞逐步被揭示的作用

与sCRS类似，患者在输注CAR-T细胞第一天的出现高浓度的CRP、铁蛋白、INFY、TNFα和峰值浓度的IL-6，有较高的风险出现神经毒性事件。研究结果表明，CAR-T细胞活化后释放高水平的血清细胞因子，包括那些可以激活内皮细胞的因子如IL-6、INFY和TNFα，这些因子诱导内皮细胞活化和血管功能障碍并扩展到CNS系统。内皮细胞在这进程中被活化，除了在临床试验中有证据显示严重的神经毒性患者有出现血管渗漏和增强渗透性的内皮细胞情况外；通过检测内皮细胞调节器的血清水平也可以被证实。

由于sCRS的发生与严重神经毒性事件的发生有着关联性，因此首选的治疗策略是实用tocilizumab和皮质类固醇药物是预防这种致命的事件。虽然tocilizumab在缓解CRS的作用明显，但它却无法阻止神经毒性的发生。事实上，tocilizumab不能穿透血脑屏障BBB，IL-6R的阻滞会引起CSF-IL-6的水平上升，从而加重神经毒性反应。以上原因证实了血管内皮细胞在该模型中的核心角色，因此治疗策略为稳定EC和防止BBB被破坏更为适宜。例如，实用BowANG1平衡调控ANG1/ANG2的比例，输入血浆消耗炎症细胞因子等手段可以在临床应用中探索和评估。另一个值得注意的观点是，与作用于其它靶点的治疗如blinatumomab相比，靶向CD19的免疫治疗的患者经历更为严重的神经毒性反应。这也同时证明，抗CD19免疫疗法能够在人体内诱导强大的T细胞或者扩增作用。

7改善CAR-T细胞安全性和有效性的策略

如上所述，能否管理CAR免疫治疗相关的危及生命的毒性反应，是瓶颈之一。实际上，在临床试验中有受试者经历严重毒性反应而死亡，因此提高其安全性和控制CAR-T细胞的超生理活性至关重要。被认为是活体治疗平台，CAR-T细胞具有智能感知和自主反应能力，一旦进入人体内就很难被控制。在探索和追求安全性效果更好的需求下，一些创新的策略正在被评估，如在CAR中设计开关控制系统、多抗原识别组件、对免疫为环境敏感的组件。

7.1开关控制系统

在开关控制创新设计中，CAR-T细胞的活性是有辅助分子控制的。辅助分子开关，可以通过消除开关来抑制T细胞的扩增，或者通过开启开关或者双向功能中间体开关来诱导T细胞的毒性。

7.1.1消除开关

长时间以来被认为是一种可靠的策略，就是将自杀开关（关闭开关）植入到CAR编码载体中，在发生毒性事件时，通过开关控制T细胞凋亡。目前最长用到的自杀开关是iCasp9系统，CASP9是基因编码和修饰的人源化caspase-9凋亡蛋白，它可以被一种小二聚体药物AP激活，在CAR-T细胞治疗的毒性反应中起到作用。抗GD2的CAR-T含有iCasp9自杀开关的CAR-T细胞后选产品，已经在治疗神经母细胞瘤和肉瘤的临床试验中被评估。另外一种开关消除策略是CAR-T细胞表达抗原决定基标识，而此标识可以被临床批准的mAb所识别。例如，CAR-T细胞表达huEGFRt，可以通过抗EGFRmAbcetuximab诱导T细胞凋亡。

然而，尽管这些自杀系统开关以最小的免疫源消除了T细胞，但可能导致CAR-T细胞消除的不可逆和癌症的复发。

7.1.2启动开关CAR

与自杀开关可能不可逆转的抑制CAR-T细胞扩增和抗肿瘤功能不同，启动开关CAR-T产品策略可以正向且精准的控制其活性。一个清晰的例子是splitCAR即抗原结合域与信号域分离；或者在细胞内CD3ζ链与CD28/4-1BB共激域分离。SplitCART细胞只有在以下两个条件都满足时才可以被完全激活：1）与靶抗原结合，2）添加可以聚合两个分离域的二聚体试剂。这项技术的成功和应用将可以允许医生通过滴定化学诱导剂来远程控制患者体内的CAR-T细胞反应的时间和强度。

7.1.3双向功能开关

另外一种方式是利用双特异性分子作为CAR-T细胞的中间体双功能开关，将CAR-T细胞结合在局部肿瘤部位通过同时靶向T细胞和TAA的方式。Blinatumab就是这项技术在临床应用的产品，它能够直接与CD3阳性非工程T细胞与表达CD19的肿瘤细胞结合，从而诱导抗肿瘤应答。Folate-FITC也是一种双功能分子的形式，能够使得抗FITC的CAR-T细胞定向靶向FR阳性肿瘤细胞。

一种更具有创新性的方法是用肽分子作为开关，将CAR-T细胞与PNE分子和TAA特异性Fab连接。sCAR-T与PNE／Ab开关例如PNE-CD19，PNE-CD20结合，而并不识别抗原；通过以被滴定的方式控制T细胞与靶细胞的相互作用，从而降低过渡激活CAR的风险。一项临床前研究表明，靶向HER2的sCAR-T细胞在胰腺肿瘤模型中达到完全缓解的结果，提示证明这种开关系统有很好的抗肿瘤效果。

从另一个维度看，抗FITC和sCAR可以被归类为普适免疫受体UIR，更确切的说是特异性UIR；其中细胞外结构域和中间体分子结合而不是与TAA结合。事实上，设计和开发一款普适化CAR是非常令人兴奋的策略，可以同时提高CAR-T细胞治疗的安全性和有效性。Cho的团队设计了一款新颖的UIR，命名为SUPRACAR。SUPRACAR是一个split受体系统，同时拥有T细胞表达的普适受体zipCAR和一个独立的靶向肿瘤细胞的scFv分子。简单来说，zipCAR包含一个融合与细胞外连接scFv分子的leucinzipper适配器CAR细胞内信号域。通过zipFv识别靶抗原后，与leucinezipperzip配对并激活zipCAR，同时触发T细胞的抗肿瘤活性。这项创新的技术带来了令人印象深刻的优势：1）不需要重新构建T细胞就可以靶向多种抗原；2）通过吊证zipFvs的剂量和改变链结构可以控制SUPRACAR的活性；3）表达多个zipCAR在同一个T细胞上成为可能，这样一个T细胞例可以包含多个不同的细胞内结构域从而识别和结合不同抗原以调节不同的信号通路。因此，SUPRACAR作为一种灵活可编程的的分离系统应运而生，它可以同时调节多个参数，从而提高CAR-T细胞治疗的有效性，特异性和安全性。

7.2多抗原识别

为了避免靶向非肿瘤细胞的毒性，“非“、”与“门线路策略被开发，以提高T细胞的特异性和分辨靶细胞的能力。

7.2.1非门线路

在非门线路中，CAR-T细胞与非肿瘤细胞的阴性抗原结合时，不能自我激活。例如当含有iCAR的CAR-T细胞遇到非靶细胞的时候会抑制其活性，这里的iCAR时包含一种细胞外通过PD-1/CTLA-4特异性识别健康组织抗原的结合域。简单的说，一旦含有PD-1/CTLA-4的iCAR与非肿瘤细胞结合时，它就会释放抑制信号从而组合CAR-T细胞被激活以及遏制随后的毒性反应。因此，这些含有非门线路的CAR-T细胞具有分辨肿瘤细胞和正常细胞的能力；同时由于iCAR的效应是暂时的或者可逆的，当CAR与靶点结合时，T细胞就会被全部激活而发挥作用。

7.2.2与门线路

相反的，与门双受体系统提供了补充信号，可以驱动而不是抑制CAR-T细胞活化。例如，CAR-T细胞可以被设计并表达合成Notch受体，该受体在结合第一个抗原的时候释放新包内转录因子，从而诱导表达特异性CAR针对第二种靶抗原。在这样的系统中，CAR-T细胞只有在联众靶抗原同时存在的情况下才会被激活并扩增，从而增强了T细胞的特异性。另一个与门线路的例子是条件性的CAR-T细胞，其中CD3ζ信号链与共激域分别设计在两个CAR中，分别识别不同的抗原。原则上，单纯激活CD3ζ信号链CAR或者共激域CAR都不足以激活T细胞的溶解活性，只有T细胞同时表达两种抗原时才可以被激活。然而，有研究表明，CD3ζ-onlyCAR的激活就可以杀死肿瘤细胞，而这些CAR-T细胞无法区分单阳性靶细胞还是双阳性靶细胞。

7.3刺激反应CAR

提高安全性的另一个方法是设计CAR仅在接触有某些物理特征的肿瘤部位时被激活，从而允许局部肿瘤被识别和特定部位的CAR-T细胞被激活。一个例子是mCAR，它包含一个遮掩肽和一个可以阻断CAR的细胞外结构域的可以被蛋白切段的链接子。这样的结构防止T细胞的脱靶激活效应，只有T细胞到达肿瘤微环境并遇到局部分泌的蛋白酶切断链接子并同时分离遮掩肽的时候才会与靶抗原结合。一项临床前研究中表明，靶向EGFR的三代mCAR在体内动物模型中表现出与传统CAR相当的抗肿瘤效果，而同时表现出更好的安全性。

另外一个被用于局部激活CAR-T细胞的微环境特征是异常肿瘤血管生成的缺氧环境。这些非常规的CAR包含一个在缺氧条件下稳定，而正常氧浓度下降解的氧敏感子域。Juillerat等学者报道，尽管氧敏感CAR在T细胞上的表达水平过低，但设计对氧浓度变化敏感的CAR-T细胞可能是调节其细胞溶解特性和提供安全性的一个潜在策略。

8实体瘤领域的挑战

尽管CAR-T细胞疗法在治疗CD19阳性血液肿瘤方面取得了显著的效果，但在向实体瘤领域的推广中却遇到了很多障碍。导致CAR-T疗法在实体瘤方向效果欠佳的原因有很多，其中周围免疫抑制肿瘤微环境TME的存在被认为是主要障碍。本文以下内容，着重讨论TME固有的特征以及克服这些敌对特征所采取的策略。

8.1肿瘤微环境对CAR-T细胞活性的影响

与血液肿瘤相比，CAR-T细胞很难达到实体瘤部位，CAR-T很难成功的：1）被运输到肿瘤部位，因为这需要T细胞和肿瘤细胞的因子之间的匹配；2）浸润基质区；3）与抗原结合后被活化；4）迅速扩增达到有效浓度对抗肿瘤负荷。同时，实体肿瘤在物理上有基质细胞产生的细胞外基质支持，这一点不同于血液肿瘤。细胞基质可以生长促血管生成，提供营养、生长因子、趋化因子，而这些都抑制T细胞的抗肿瘤效果，从而阻断CAR-T治疗进程。事实上，基质相关的抗原可能成为CAR-T细胞治疗在实体瘤领域应用的潜在靶点。Wang和团队开发出一种FAP特异性CAR，FAP被发现在肿瘤基质中表达量很高，实验结果表明当FAP+减少时，肿瘤生长速度显著降低。

进一步优化CAR-T细胞，使其可以表达相应的趋化因子受体能够与同源肿瘤衍生的趋化因子配对，可以改善CAR-T在体内的运转从而增强抗肿瘤活性，这方面的应用如CCR2b在抗GD2-CAR在CCR2b中、CCR2在MSLNCAR中、以及CCR4在抗CD30-CAR中。然而需要注意，这些额外的趋化因子受体可以导致T细胞的异常信号传导，甚至拖把效应。最近一种新的策略用语提高CAR-T细胞浸润，是机遇整合蛋白的反向控制现象。它通过PKA抑制α4integrin的磷酸化，从而增强integrinαLβ2介导的T细胞迁移。在这方面，有研究证明α4(SA)基因突变（抑制α4PKA-介导磷酸化）的B16黑色素瘤模型小鼠，比野生型模型小鼠呈现更高的T细胞浓度，这可能是潜在的治疗实体瘤的策略。

即使CAR-T细胞成功在肿瘤浸润，四周微环境也提供了恶劣的条件，包括缺氧、血管生成、细胞外基质、营养补充足、酸性pH、氧化应激、抑制性细胞因子、可溶性因子；这些阻碍T细胞的扩增和保持。第四代可以粉笔活化细胞因子的CAR-T细胞，以及第五代具有内源性细胞因子信号功能的CAR，应用第四代和第五代技术可能有主语提高T细胞的增殖能力和存活率。

此外，存在大量的免疫抑制细胞，如Tregs、MDSCs、TAM、TAN等，在TME下CAR-T细胞毒性功能被抑制，同时也阻止了各种免疫细胞向肿瘤组织的聚集。在评估抗GD2的第三代CAR治疗神经母细胞瘤的临床试验中，观察到徐恩华免疫抑制性髓细胞（主要M2）的大量增加。这一发现提示，TME利用免疫抑制细胞对抗抗GD2CAR-T细胞输注的反应，这会抵消治疗的效果。类似的，O’Rurke团队在一项治疗复发角质母细胞瘤的临床试验中报道，靶向EGFR的CAR-T细胞输注后大量免疫抑制性的treg和抑制分子（IDO1,PD-L1和IL-10）的表达量很高。再一次证明，CAR-T细胞被激活后，体内出现代偿性的肿瘤介导的免疫抑制反应。此外，T细胞内在的调节机制，如协同抑制受体（CTLA4、PD-1）的上调，使得其配体在肿瘤细胞内高度表达，细胞内促凋亡途径被激活，从而进一步放大了免疫抑制环境的效果，导致T细胞功能减弱或衰竭。

8.2在研的实体瘤靶点

除了TME的物理、化学、代谢和免疫抑制瓶颈外，由于实体瘤固有的抑制性，很难识别独特的肿瘤靶点，这是另一个需要克服的挑战。正如在第一个实体瘤的临床试验中报道的那样，CAR-T细胞治疗有很高的靶向非肿瘤细胞的毒性反应风险，这是由于大多数抗原既不是肿瘤特异性表达的，也不仅限于表达在肿瘤细胞中。相较于传统的单一靶点CAR-T细胞结构，多靶点、或者门线路设计的CAR，例如multi、pooled、和tandemCAR-T细胞，可能是一个可靠的策略增强TAA靶向性。

目前，多个CAR可能识别的靶点正在研究中，包括：1）如EGFRvIII，新抗原（即肿瘤特异性突变引起的相关突变）；2）如MUC1和MUC16，糖基化生成的抗原；3）如FAP和VEGF受体-2，肿瘤基质和血管相关抗原；4）如MSLN，IL-13Rα2,GD2,和PSMA，在健康细胞上表达的低水平肿瘤特异性抗原；5）如CEA，发育的或胚胎抗原。其中，MSLN,PSMA,GD2,IL-13Rα2,HER2,MUC1,MUC16和EGFRvIII这些靶点正在临床应用中被评估和检验。

8.3克服免疫抑制

很多尝试和探索来防止肿瘤介导的T细胞抑制，T细胞被抑制主要是通过损害PD-1/CTLA4抑制轴，这种已知的肌理诱导T细胞衰竭和凋亡。一个应用的例子是在CAR-T细胞上，使用CRISPR/Cas9技术，对PD-1/CTLA-4受体进行基因编码进行破坏。一项临床前研究结果提示，PD-1缺陷的抗CD19CAR-T细胞在移植PD-L1+肿瘤模型中具有更大的抗肿瘤活性。目前，CRISPR/Cas9基因编辑的CAR-T细胞正在临床阶段评估对MSLN阳性实体瘤的效果。

Cherkasky团队根据基因沉默的原则，成功的将抗MSLNCAR-T细胞导入表达对应靶向PD-1的shRNA基因载体。携带shRNAs基因的PD-1使得PD-1内源性下调，促进了CAR-T细胞进一步扩增和裂解，从而作用与MSLN/PD-L1阳性肿瘤细胞。同样的研究还发现了一种PD-1显性负性受体DNR的存在，这种受体与内源性受体竞争，通过阻止PD-1:PD-Ls来恢复CAR-T细胞的活性。值得注意的是，截短的抑制性受体也被应用于CAR-T细胞治疗；例如利用负性TGFβ受体II抵消肿瘤免疫抑制性细胞因子TGFβ的负作用。

另一个有希望的方式是通过嵌合开关受体CSR将PD-1/CTLA4的抑制信号转化为激活信号，作为与CD28共激分子的细胞外结构域。在早期的相关研究中有报道，利用基因工程转染的表达PD1:CD28的CD8阳性毒性T细胞，能够与PD-L1阳性肿瘤细胞结合同时通过CD28的作用提供PD-L1介导的共激信号，从而增强该T细胞的毒性和增值能力。刘的团队，成功的将PD1:CD28CSR转染到二代的抗MSLN和抗PSCACAR-T细胞中，这一技术机遇PD-L1的结合功能也同时将二代技术提升为三代技术。在胸膜间皮瘤和前列腺癌模型的研究中，结果表明用PD1:CD28CSR转染的T细胞显示出更高的存活率、增值率和抗肿瘤活性，这一结果进一步支持该技术有能够克服T细胞被诱导造成的功能减退和衰竭的潜力。

另一种可行的方案是联合CAR-T细胞治疗和能够阻断PD-1/CTLA4抑制性受体和配体相互作用的mAb一起给药。事实上，在临床前模型和临床试验的研究中，有结果表明奖CAR-T细胞治疗与检查点阻断疗法相结合能够增强其抗肿瘤活性以及降低T细胞的衰竭。尽管如此，CAR-T细胞与免疫检查点抑制剂的联合治疗方案的临床获益仍然需要进一步的评估，这是因为所谓的在人体内CAR-T细胞的扩增和持久性有提高这一效果的确证还是有争议的。此外两者的协同作用依赖于高剂量和高频率使用Ab，因为低剂量的Ab并不能抑制肿瘤生长或者提高CAR-T细胞的抗肿瘤作用。

更新的联合方式也在兴起，例如利用CAR-T细胞自身的优势，让T细胞自身产生和分泌Ab衍生的检查点抑制剂。利用这一思路，抗CAIXCAR-T细胞分泌抗PD-L1mAb产品就是通过基因编辑抗CAIXCAR和抗PD-L1IgGs的慢病毒载体转染T细胞开发而来的。通过阻止PD-1:PD-L1相互作用，减少PD-L1介导T细胞衰竭，增强抗CAIXCAR-T细胞的存活率和抗肿瘤活性。在肾癌小鼠模型中的研究结果表明，抗PD-L1mAb的释放可以使NK细胞向肿瘤部位富集，从而增强ADCC对肿瘤细胞的杀死作用；与对照组相比肿瘤减少增长五倍。类似的研究在肺癌小鼠模型中，李的团队证实了，基因改造后分泌抗PD-1scFvs的抗CD19CAR-T细胞有增强的肿瘤细胞杀死作用。这些创新的技术，已经进入在MUC1、EGFR、MSLN阳性的晚期实体瘤的临床研究阶段。

9未来展望

抗CD19CAR-T细胞治疗在临床应用中的高应答率，使其成为近年来肿瘤免疫治疗领域的突破性疗法。同时，FDA先后批准了两款抗CD19CAR-T细胞治疗产品用于治疗难治B细胞恶性肿瘤，这更加促使生物科技公司开发新型的CAR-T细胞治疗产品并在临床前模型和临床应用中评估其效果。

然而，CAR-T细胞治疗在临床应用上的成功却同时也可能伴随严重或危机生命的副作用，甚至出现死亡不良事件。另外，由于强烈的免疫抑制环境作用和缺乏特异性肿瘤抗原，将CAR-T疗法应用在实体瘤的治疗并没有得到很好的临床获益。幸运的是，为克服这些挑战，科学家在开发新的策略，应用高度创新并且安全的技术，例如1）设计普适CAR并带有开关控制系统；2）识别组合抗原策略；3）共激结构；4）多靶CAR设计，期待这些创新能够精准的调控CAR-T细胞抗肿瘤活性同时避免毒性反应。

在实体瘤治疗领域，对PD-1/CTLA4抑制轴的识别是关键TME介导的免疫抑制因子，这一研究推动了非传统的研究策略，包括基因沉默技术、抑制性截短受体、和使用单克隆抗体检查抑制剂破坏抑制机制的联合疗法。此外，此外，为CAR-T细胞装备免疫调节因子，例如细胞因子、Ab衍生的检查点抑制剂、或者表达第五代CARs，这些策略都将进一步增强调节TME的可行性，将免疫抑制环境转化为免疫允许环境。

未来的CAR技术将会朝着开发多功能智能T细胞的方向发展，通过倾向性的重新调节TME，产生复杂的免疫反应使其在不同的肿瘤中产生相对应的抗肿瘤效果。

原文来源：TeresaRAbreu,NunoAFonseca,NélioGon?alves,Jo?oNunoMoreira.CurrentChallengesandEmergingOpportunitiesofCAR-TCellTherapies.JControlRelease,,-.2Dec30[Onlineaheadofprint]

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